全自動(dòng)機(jī)械臂固相萃取儀－高效液相色譜法檢測(cè)豬肉中13種磺胺類藥物殘留量
1 前言
近年來(lái)，越來(lái)越多的研究結(jié)果表明，磺胺類藥物特別是磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲基異惡唑等殘留對(duì)人體的危害主要表現(xiàn)為“致癌、致畸、致突變”作用，引起過(guò)敏、中毒和導(dǎo)致耐藥性菌株產(chǎn)生，以及引起造血系統(tǒng)障礙、急性溶血性貧血、粒細(xì)胞缺乏癥、再生障礙性貧血等。加強(qiáng)磺胺殘留的檢測(cè)及監(jiān)控是控制獸藥殘留發(fā)生的重要措施之一。采用海能全自動(dòng)固相萃取儀-高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)動(dòng)物源性食品中磺胺類藥物殘留，有效的縮短樣品中目標(biāo)物的固相凈化所需要的時(shí)間，提高了工作效率，也節(jié)約了人力；且能精準(zhǔn)的控制上樣、淋洗、洗脫等溶劑流速，提高了樣品目標(biāo)物的回收率。
2 儀器與試劑
2.1 儀器
SPE400全自動(dòng)機(jī)械臂固相萃取儀；HN200多功能氮吹儀；高效液相色譜儀；絞肉機(jī)；粉碎機(jī)；分析天平；離心機(jī)；其他常規(guī)玻璃儀器；濾膜（有機(jī)相，0.22μm）。
SPE 400 全自動(dòng)機(jī)械臂固相萃取儀
2.2試劑及耗材
實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682中三級(jí)用水的規(guī)格，使用試劑除特殊說(shuō)明外，均為分析純。
乙酸乙酯（色譜純）；乙腈（色譜純）；甲醇（色譜純）；鹽酸、正己烷、甲酸（色譜純）、氨水。
MCX柱：60mg/3ml，或者相當(dāng)。
0.1%甲酸溶液：取甲酸1mL，用水溶解并稀釋至1000mL。
0.1%甲酸乙腈溶液：取0.1%甲酸830mL，用乙腈溶解并稀釋至1000mL。
洗脫液：取氨水5mL,用甲醇溶解并稀釋至100mL。
0.1mol/L鹽酸溶液：取鹽酸0.83mL，用水溶解并稀釋至100mL。
50%甲醇乙腈溶液：取甲醇50mL，用乙腈溶解并稀釋至100mL。
3實(shí)驗(yàn)方法
3.1取樣
取適量新鮮或解凍的供試組織，采用絞碎機(jī)絞碎，并用粉碎機(jī)將其粉碎均質(zhì)。
3.2提取
精確稱取均質(zhì)好的試料5g于聚四氟乙烯離心管中，加入乙酸乙酯20mL，搖動(dòng)5min，將試樣分散開，在2000r/min下離心10min，取上層清液與100mL容量瓶中；殘?jiān)性偌尤?/span>20mL乙酸乙酯，重復(fù)抽提一次，合并兩次提取液于容量瓶中。
3.3脫脂
在容量瓶中加0.1mol/L鹽酸溶液4mL，于40℃下氮吹濃縮至少3mL，轉(zhuǎn)入10ml離心管中，用0.1mol/L鹽酸溶液2mL洗容量瓶。并轉(zhuǎn)至同一試管中。再用正己烷3mL洗容量瓶，將正己烷轉(zhuǎn)至同一離心管中，晃動(dòng)離心管將其混合均勻，在2000r/min下離心10min，棄去正己烷。再次用正己烷3mL洗容量瓶，轉(zhuǎn)至同一離心管中，搖晃離心管將樣品在溶劑中混合均勻，在2000r/min下離心10min，棄去正己烷。取下層液備用。
3.4固相萃取小柱凈化（MCX柱）
表1 固相凈化條件
濃縮、轉(zhuǎn)化溶劑：收集洗脫液，于40℃氮?dú)獯蹈?；加?/span>0.1%甲酸乙腈溶液1.0ml溶解殘余物，濾膜過(guò)濾，供高效液相色譜測(cè)定。
3.5色譜測(cè)定條件
色譜柱：C18；
流動(dòng)相：0.1%甲酸+乙腈，梯度如下表；
流速：1mL/min；
柱溫：30℃；
檢測(cè)波長(zhǎng)：270nm；
進(jìn)樣體積：100μL。
表2 梯度表
3.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
精密將磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成濃度為10、50、100、250、500、2500和5000μg/L系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，供液相色譜使用。以測(cè)得的峰面積為縱坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。
3.7測(cè)定
將樣品按照與標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制時(shí)相同的色譜條件進(jìn)行測(cè)試，得到樣品色譜峰的峰面積，根據(jù)所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出樣品中磺胺類藥物的濃度。
4結(jié)果計(jì)算
試樣中磺胺類藥物殘留量計(jì)算：
其中：X——試樣中相應(yīng)的磺胺類藥物的殘留量，單位微克每千克（μg/kg）；
C——試樣中相應(yīng)的磺胺類藥物濃度，單位微克每毫升（μg/mL）；
V——溶解殘余物所用0.1%甲酸乙腈溶液體積，單位毫升（mL）；
m——供試樣品質(zhì)量，單位為克（g）；
參考文獻(xiàn)
[1] GB 29694-2013食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 動(dòng)物性食品中13種磺胺類藥物多殘留的測(cè)定 高效液相色譜法[S].