液相色譜法測(cè)定食品中的甜菊糖苷
1 前言
甜菊糖又稱甜菊苷，它是從菊科植物甜葉菊的葉子中提取出來(lái)的一種糖苷。甜葉菊原產(chǎn)于巴拉圭和巴西，現(xiàn)在中國(guó)、新加坡、馬來(lái)西亞等國(guó)家也有種植，其甜味成分由甜菊苷及甜菊A苷、B苷、C苷、D苷和E苷組成。
甜菊糖甙（俗稱甜菊糖、甜菊糖苷）是一種從菊科草本植物甜葉菊（或稱甜菊葉）中精提的新型天然甜味劑，而南美洲使用甜葉菊作為藥草和代糖已經(jīng)有幾百年歷史。國(guó)際甜味劑行業(yè)的資料顯示，甜菊糖甙已在亞洲、北美、南美洲和歐盟各國(guó)廣泛應(yīng)用于食品、飲料、調(diào)味料的生產(chǎn)中。中國(guó)是全球最主要甜菊糖甙生產(chǎn)國(guó)。
甜菊糖甙甜度為蔗糖的250~450倍，帶有輕微澀味，甜菊A苷帶有明顯的苦味及一定程度的澀味和薄荷醇味，味覺(jué)特性要比甜菊雙糖苷A差些，適度可口，純品后味較少，是最接近砂糖的天然甜味劑,甜菊糖苷甜度高，且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，無(wú)褐變，極利于保持飲料、食品的本色。
針對(duì)目前國(guó)內(nèi)食品行業(yè)（例如飲料、糕點(diǎn)、糖果）中添加甜菊糖的情況，海能儀器推出了食品中甜菊糖苷的高效液相色譜測(cè)定方法
2 實(shí)驗(yàn)部分
2.1 基本原理
樣品中甜菊糖苷經(jīng)溶劑提取凈化后，供高效液相色譜儀（紫外檢測(cè)器）檢測(cè)，外標(biāo)法定量。
2.2 試劑與材料
除另有說(shuō)明外，所用試劑均為分析純
乙腈（色譜純）。
磷酸。
石油醚。
0.002 mol/L 磷酸溶液：精密稱取0.196 g 磷酸于1000 mL 容量瓶中，加水定容至刻度。
甜菊糖苷（ Stevioside C38H60O18）標(biāo)準(zhǔn)品：含量>99.7 % CAS 57817-89-7。
甜菊糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密稱取甜菊糖苷標(biāo)準(zhǔn)品10 mg 于10 mL 容量瓶中，加1 ml 乙腈，溶解后加水定容至刻度，得甜菊糖苷濃度為1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。
甜菊糖苷標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的制備：精密吸取甜菊糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液0.05 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1.0mL 于10 mL 容量瓶中，加水稀釋并定容至刻度，得濃度為5.0 μg/mL、10.0 μg/mL、20.0 μg/mL、50.0 μg/mL、100.0 μg/mL 的甜菊糖苷的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。取此系列標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，使用0.22 nm 有機(jī)濾膜過(guò)濾后待測(cè)。
2.3 儀器與設(shè)備
海能LC7000液相色譜儀：配紫外檢測(cè)器。
電子分析天平：感量1 mg。
混勻器。
離心機(jī)，轉(zhuǎn)速大于5000 r/min。
濾膜：0.22 μm 有機(jī)濾膜。
2.4 樣品的制備
液體樣品：
稱取5.0 g 試料，于10 mL 燒杯中，精確至0.01 g，加流動(dòng)相適量，混勻后，移入50mL 容量瓶中，加流動(dòng)相定容至刻度。充分振蕩混勻后，過(guò)0.22 μm 有機(jī)濾膜待測(cè)。
水溶性固體樣品：
取有代表性的混合均勻試料2.5 g，于10 mL 燒杯中，精確至0.01 g，加流動(dòng)相適量，混勻后，移入50 mL 容量瓶中，加流動(dòng)相定容至刻度。充分振蕩混勻后，過(guò)0.22 μm 有機(jī)濾膜待測(cè)。
水不溶性試料：
取有代表性的混合均勻試料2.5 g，于10 mL 燒杯中，精確至0.01 g，移入50 mL離心管中，加15 ml 石油醚渦旋振蕩5min，在5000 r/min 下離心10 min，將上清液棄去，殘?jiān)性偌?/span>15 mL×3 石油醚，重復(fù)以上步驟3 次，棄去上清液，氮?dú)獯蹈蓺堅(jiān)?。殘?jiān)屑?/span>1 g 無(wú)水硫酸鈉和8 m0.22μm有機(jī)濾膜乙腈，渦旋振蕩5 min，在5000 r/min 下離心10 min，上清液置于25 mL 比色管中，重復(fù)提取1 次，氮?dú)獯蹈珊螅瑲堅(jiān)昧鲃?dòng)相全量轉(zhuǎn)移到50 mL 容量瓶中并定容至刻度。充分混勻后過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜待測(cè)。
2.5 分析步驟
色譜條件
色譜柱：C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）
流動(dòng)相：0.002 mol/L磷酸溶液+乙腈=70+30；
流速：1.0 mL/min；
柱溫：30 ℃:；
波長(zhǎng)：210 nm；
進(jìn)樣量：10μL。
3 結(jié)果與分析
3.1 測(cè)定
精密吸取試料和標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按規(guī)定色譜條件分別進(jìn)樣10 μL，以甜菊糖苷保留時(shí)間定性，外標(biāo)法峰面積定量。標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見下圖。
式中：
X—試料中甜菊糖苷含量，mg/kg；
C—從標(biāo)準(zhǔn)曲線中算出試液中甜菊糖苷的濃度，μg/mL；
m—試料質(zhì)量或體積，g 或ml；
V—試料定容體積，mL。
3.2 重復(fù)性
見下圖
圖中可見，甜菊糖苷連續(xù)5針進(jìn)樣，峰面積重復(fù)性RSD%0.004，保留時(shí)間重復(fù)性良好，完全滿足方法要求。
3.3 線性范圍和檢出限
本方法的線性范圍為5.0 μg/mL～100.0 μg/mL。檢出限為4.00 mg/kg。